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Dernière mise à jour : Mai 2018

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SPS - Saclay Plant Sciences

Un arc en ciel pour explorer la cellule végétale

Les analyses multi-couleurs en cytométrie en flux

Le consortium Saclay Plant Sciences et la plateforme Imagerie-Gif ont largement exploité la puissance de la cytométrie pour comprendre la biologie des plantes. Tomate, blé, Arabidopsis, tabac, vanille sont autant de modèles expérimentaux analysés par nos cytomètres, à côté de populations plus timides comme la flore des Balkans ou des îles Kerguelen. Les plantes sont traitées par cytométrie pour des études variées : analyse de génome, de cycle cellulaire, de suivi de biosenseurs, de cartographie de protéines dans le temps et l’espace, etc.

La cytométrie joue ainsi un rôle de guide important dans la politique de conservation des variétés (Chaintreuil et al. 2016 ; Hajrudinović et al. 2015 ; Razafinarivo et al. 2012). Des études d’analyses de génome ont permis de distinguer et préserver des populations de cacaoyer ancestral au milieu d’autres plantations au cœur de la forêt amazonienne (Argout et al. 2010). La cytométrie a également permis de détecter un nouveau processus de remodelage de l’ADN dans les orchidées. La description de ce phénomène unique d’endoréplication stricte partielle dans la vanille (Fig. 1) (collaboration ESE, IPS2, I2BC, CIRAD) (Brown et al. 2017) ouvre de nouvelles voies pour les programmes de culture.

Cytometry 1

Figure 1 : Vanilla ×tahitensis est un exemple d’endoréplication partielle stricte se produisant chez les Orchidaceae. Pendant le développement de la plante, seulement 28% du génome est endorépliqué. Photo Maurice Wong, Service du Développement Rural, BP 100, 98713 Papeete Tahiti, Polynésie Française

Cytométrie versus Imagerie

Cytométrie en flux et Imagerie aiment se rejoindre sur les bords de la fluorescence. La cytométrie en flux insiste sur ses capacités à quantifier le nombre et l’intensité d’objets fluorescents et se fait forte de sa haute sensibilité pour détecter les signaux les plus faibles. Néanmoins, le cytomètre exige que l’objet puisse être correctement isolé pour être identifié tandis que la microscopie aime à regarder l’objet dans son environnement tissulaire.

Par-delà cette différence, microscopes et cytomètres s’accordent sur un point : la difficulté de jouer avec la cellule végétale. En effet la présence d’une paroi et d’organites très réfringents, voire opaques, et la présence de nombreux composés autofluorescents complexifient les approches d’exploration subcellulaire basées sur la fluorescence.

En s’adressant à des objets isolés (protoplastes, noyaux, organelles par exemple), la cytométrie en flux contourne la difficulté. De plus, elle utilise jusqu’à 22 détecteurs pour explorer toute la gamme de spectres fluorescents, ce qui permet de réaliser des « analyses multi-couleurs » et de corréler les données biologiques dans l’espace et dans le temps.

L’analyse multi-couleurs, quelques exemples

La capacité de nos cytomètres à réaliser des analyses multi-couleurs donne une boîte à outils puissante à la communauté végétale pour étudier des processus biologiques au niveau cellulaire. L’analyse « bi-couleur » de l’expression de protéines fluorescentes rapporteurs telles que la GFP, utilisée pour marquer les chromosomes, a permis à l’équipe de Moussa Benhamed (IPS2) de montrer que les variations d’expression de la protéine nucléaire Kip-Related Protein5 (taggée par la GFP) sont corrélées aux processus d’endoréplication (révélés par un marquage DAPI), la production de KRP5 augmentant avec le niveau d’endoploïdie (Fig. 2) (Jegu et al. 2013).

Cytometry 2

Figure 2 : L’expression de KRP5 est corrélée avec l’endoréplication. La distribution du contenu en ADN des noyaux isolés positifs en GFP (GFP+) ou négatifs en GFP (GFP-) à partir de feuilles de rosettes de 14 jours d’Arabidopsis KRP5::NTF-GFP. Le nuage de points montre comment les noyaux GFP+ sont sélectionnés en se basant sur l’intensité de fluorescence (chaque noyau est représenté par un point rouge).

De la même manière, la détection d’une activité biologique par multi-immunomarquage est l’une des forces de l’analyse multi-couleur en cytométrie. En s’appuyant sur une analyse « trois couleurs » de noyaux issus du péricarpe de tomates, a été mise en évidence une différence d’activation de la RNA-polymérase II (RNA-Pol II) en fonction du niveau d’endoréplication. Dans ce cas, la RNA-Pol II phosphorylée active était marquée avec un anticorps couplé à l’Alexa-488 (fluorescence verte), la RNA-pol II non phosphorylée inactive était marquée par un anticorps couplé à l’Alexa-647 (fluorescence rouge) et l’ADN des noyaux était marqué avec du DAPI (fluorescence bleue). L’analyse de ce marquage 3 couleurs a permis de démontrer que l’activité de la RNA-Pol II augmentait avec le niveau d’endoréplication (Fig. 3) (Pirello et al. 2014).

Cytometry 3

Figure 3 : L’endoréplication est accompagnée d’une augmentation de l’activité transcriptionnelle pendant le développement du fruit de tomate. Une suspension nucléaire de péricarpe de fruit a été doublement immuno-marquée en utilisant des anticorps reconnaissant la forme active (S2P phosphorylée) et inactive (NP non phosphorylée) de l’ARN polymérase II, colorée avec du DAPI, et analysée par cytométrie en flux pour quantifier la fluorescence des anticorps en fonction des niveaux d’endoréplication (codés en couleur).

L’analyse multi-couleurs peut aussi être combinée à l’utilisation de protéines photoconvertibles pour réaliser des « pulse-chases » in cellulo, comme le montre une étude réalisée pour quantifier la synthèse de membranes golgiennes, basée sur la quantification d’un marqueur golgien lié à la protéine photoconvertible Kaede. Les membranes golgiennes ont d’abord été évaluées par la fluorescence verte du rapporteur lié à Kaede au cours des différentes phases du cycle cellulaire. La conversion de la fluorescence de Kaede du vert vers le rouge marquait le temps 0 du pulse-chase. La réapparition de fluorescence verte était alors associée à la synthèse de novo des protéines du Golgi. Cette analyse 4 couleurs a permis de décrire, pour la première fois, que la phase tardive G1 était une étape majeure dans la synthèse de protéines golgienne (Bourge et al. 2015).

Des équipements à votre disposition

Compter, trier, mesurer, analyser une pléthore d’objets fluorescents sont l’apanage de la nouvelle génération de cytomètres avec des capteurs de plus en plus sensibles pour la détection des signaux fluorescents. De nombreux protocoles sont proposés par la plateforme de Cytométrie SPS afin de lever les verrous méthodologiques inhérents aux cellules végétales. Notre analyseur CytoFlex est capable de détecter jusqu’à 17 couleurs (GFP, mCherry, chlorophylle, etc.). Cette équipement « user-friendly » permet à tout utilisateur de devenir en quelques heures un cytométriste averti pour quantifier sa protéine fluorescente préférée ou réaliser des analyses de cycles cellulaires et mesurer des tailles de génome. Le cytomètre trieur Astrios préfère quant à lui se faire manipuler par les experts, Mick Bourge et Nicolas Valentin, pour isoler, purifier, caractériser des populations fluorescentes

Ces 2 cytomètres sont prêts à s’attaquer à vos questions biologiques.
Venez discuter de vos projets !

Contacts

Béatrice SATIAT-JEUNEMAITRE (Responsable scientifique)
Mickael BOURGE (Responsable scientifique et technique)
Nicolas VALENTIN (Ingénieur)

Site web : https://www.i2bc.paris-saclay.fr/spip.php?article1371

Références

Argout, X. et al. (2011). The genome of Theobroma cacao. Nat. Genet. 43: 101–108.

Bourge, M., Fort, C., Soler, M.-N., Satiat-Jeunemaître, B., and Brown, S.C. (2014). A pulse-chase strategy combining click-EdU and photoconvertible fluorescent reporter: tracking Golgi protein dynamics during the cell cycle. New Phytol. 205: 938–950.

Brown, S.C., Bourge, M., Maunoury, N., Wong, M., Bianchi, M.W., Lepers-Andrzejewski, S., Besse, P., Siljak-Yakovlev, S., Dron, M., and Satiat-Jeunemaitre, B. (2017). DNA Remodeling by Strict Partial Endoreplication in Orchids, an Original Process in the Plant Kingdom. GENOME Biol. Evol. 9: 1051–1071.

Chaintreuil, C. et al. (2016). The evolutionary dynamics of ancient and recent polyploidy in the African semiaquatic species of the legume genus Aeschynomene. New Phytol. 211: 1077–1091.

Hajrudinovic, A., Siljak-Yakovlev, S., Brown, S.C., Pustahija, F., Bourge, M., Ballian, D., and Bogunic, F. (2015). When sexual meets apomict: genome size, ploidy level and reproductive mode variation of Sorbus aria s.l. and S. austriaca (Rosaceae) in Bosnia and Herzegovina. Ann. Bot. 116: 301–312.

Jegu, T. et al. (2013). Multiple Functions of Kip-Related Protein5 Connect Endoreduplication and Cell Elongation. Plant Physiol. 161: 1694–1705.

Pirrello, J., Bourdon, M., Cheniclet, C., Bourge, M., Brown, S.C., Renaudin, J.-P., Frangne, N., and Chevalier, C. (2014). How Fruit Developmental Biology Makes Use of Flow Cytometry Approaches. Cytom. PART A 85: 115–125.

Razafinarivo, N.J., Rakotomalala, J.-J., Brown, S.C., Bourge, M., Hamon, S., de Kochko, A., Poncet, V., Dubreuil-Tranchant, C., Couturon, E., Guyot, R., and Hamon, P. (2012). Geographical gradients in the genome size variation of wild coffee trees (Coffea) native to Africa and Indian Ocean islands. TREE Genet. Genomes 8: 1345–1358.

Voir aussi

Revue:
Flow cytometry as tool in plant sciences, with emphasis on genome size and ploidy level assessment
Mickaël Bourge, Spencer C. Brown, Sonja Siljak-Yakovlev
Genetics & Applications
2018