Un équipement de MicroScaleThermophoresis (MST) cofinancé par le LabEx SPS, AgroParisTech, la région Ile de France et l’Institut Jean-Pierre Bourgin (IJPB) a été acquis en 2015 et installé au sein de la plateforme de Biochimie de l’Observatoire du Végétal (OV) à l’IJPB, sur le site INRA de Versailles.  Par le biais de l’OV-Biochimie, la technique de MST est mise à disposition des personnels du LabEx SPS et du collectif enseignement/recherche de l’Université Paris-Saclay et, plus largement, est accessible à tous nos partenaires institutionnels.

Basée sur le principe de la thermophorèse, la MicroScaleThermophoresis permet la mise en évidence d’interactions moléculaires entre biomolécules de natures physico-chimiques différentes, purifiées ou non.

L’équipement que nous avons acquis permet de détecter des variations de la mobilité d’une molécule fluorescente (naturellement ou par marquage fluorescent) soumise à un micro-gradient de température établi dans un capillaire, en présence de concentrations croissantes d’un interactant spécifique. L’exploitation des propriétés thermophorétiques d’un composé pour des études d’interactions moléculaires constitue une approche innovante.

https://doi.org/10.1016/j.molstruc.2014.03.009

(A) Un appareil de mesure de thermophorèse (MST-Monolith NT.115 de NanoTemper Technologies GmbH). (B) Représentation schématique du système optique. Les molécules fluorescentes dans les capillaires (16 capillaires de ~ 4 μL) sont excitées et la fluorescence détectée par le même objectif. Un laser IR chauffe localement et la thermophorèse des molécules fluorescentes à travers le gradient de température est détectée (C) Initialement, les molécules sont distribuées de manière homogène et une "fluorescence initiale" constante est enregistrée. Après l'activation du laser IR, le mouvement thermophorétique des molécules fluorescentes hors du point chauffé par le laser est mesuré. Après la désactivation du laser IR, il se produit une "backdiffusion" de molécules, uniquement due à la diffusion (D) Le mouvement thermophorétique d'une molécule fluorescente (trace noire, "non liée") change lors de la liaison à un ligand non fluorescent (trace rouge, "lié"), ce qui entraîne des courbes différentes. Le titrage du ligand non fluorescent entraîne un changement progressif de la thermophorèse, qui est représenté par ∆Fnorm pour donner une courbe de liaison, dont dérivent les constantes d’affinité.

Au-delà de sa simplicité de mise en œuvre, la MST présente les avantages suivants :

• Sensibilité : cette technique repose sur l’enregistrement de variations minimes de masse, de charge ou de solvatation. Elle permet la mesure d’interactions sans limite minimale de taille de molécules.
• Mesures en solution : contrairement à d’autres techniques d’études d’interaction, il n’y a pas d’immobilisation et donc pas de perturbation de conformation à craindre.
• Domaines d’application très larges : protéine/protéine, protéine/ligand, protéine/sucre, protéine/ADN, ligand/particule virale, bactérie, cellule, etc.
• Marquage fluorescent d’une protéine purifiée : le marquage, soit sur des lysines soit sur des cystéines contenues dans la protéine, peut être réalisé en moins d’une heure.
• Purification des espèces en présence non nécessaire : pour des protéines-fusions avec la GFP par exemple, des extraits cellulaires peuvent être analysés directement sans purification, ce qui permet de maintenir en présence tous les partenaires nécessaires à l’interaction (protéine partenaire, cofacteur etc.)
• Possibilité d’exploiter la fluorescence de différentes molécules, acides nucléiques ou oligosaccharides marqués, par exemple.
• Consommation faible de l’espèce marquée : 10 µl d’une solution pM à nM, avec une gamme dynamique de constantes de dissociation élevée  (K_D 10^-11 à 10^-2 M).
• Rapidité : différentes conditions expérimentales peuvent être testées rapidement, comme le pH, en présence de sels, de détergents, etc. ou encore selon le type de capillaire (standards ou greffés). Une fois les conditions expérimentales établies, les constantes de dissociation peuvent être obtenues en 10 min.
• Coût raisonnable des consommables : environ 300 € pour 1000 capillaires standard.
• Logiciel d’acquisition et de traitement des données à utilisation très intuitive.

La MST exige rigueur et précision de la manipulation, en particulier en ce qui concerne la distribution du partenaire fluorescent, mais sa simplicité d’utilisation permet néanmoins de proposer cette méthode d’étude d’interaction sur un plateau technique après une courte formation. La MST peut également permettre à des étudiants d’appréhender la notion d’interaction spécifique et de mesurer  expérimentalement des constantes de dissociation.

Depuis l’acquisition de cet équipement de MST, les personnels de l’IJPB, ont obtenu des résultats encourageants dans le cadre de différents programmes de recherche et d’autres sont en cours de publication. Des interactions entre récepteurs et ligands peptidiques, ou récepteur et hormone, ou encore entre un facteur de transcription et sa cible ADN ont été mises en évidence.

L’Observatoire du Végétal propose d’accueillir les scientifiques du LabEx SPS afin de leur permettre de s’approprier la méthode, d’initier ensemble les premiers essais exploratoires et d’étudier l’adaptation de la technique de MST aux interactions moléculaires potentielles étudiées.

Références

Article de référence :

Wienken CJ, Baaske P, Rothbauer U, Braun D, Duhr S. Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis. Nat Commun. 2010 Oct 19;1:100. doi: 10.1038/ncomms1093. PMID: 20981028

Interaction protéine/ protéine :

Chen ST, He NY, Chen JH, Guo FQ. Identification of core subunits of photosystem II as action sites of HSP21, which is activated by the GUN5-mediated retrograde pathway in Arabidopsis. Plant J. 2017 89(6):1106-1118. doi:10.1111/tpj.13447. Epub 2017 Feb 27. PubMed PMID: 27943531.

Sénéchal F, L'Enfant M, Domon JM, Rosiau E, Crépeau MJ, Surcouf O, Esquivel-Rodriguez J, Marcelo P, Mareck A, Guérineau F, Kim HR, Mravec J, Bonnin E, Jamet E, Kihara D, Lerouge P, Ralet MC, Pelloux J, Rayon C. Tuning of Pectin Methylesterification: Pectin methylesterase inhibitor 7 modulates the processive activity of co-expressed pectin methylesterase 3 in a PH-dependent manner. J Biol Chem. 2015 290(38):23320-35. doi: 10.1074/jbc.M115.639534. Epub 2015 Jul16. PubMed PMID: 26183897; PubMed Central PMCID: PMC4645611.

Interaction protéine/ petite molécule :

Zhang W, Li X, Zhang G, Ding Y, Ran L, Luo L, Wu J, Hu D, Song B. Binding interactions between enantiomeric α-aminophosphonate derivatives and tobacco mosaic virus coat protein. Int J Biol Macromol. 2017 Jan;94(Pt A):603-610. doi: 10.1016/j.ijbiomac.2016.10.027. Epub 2016 Oct 13. PubMed PMID: 27746356.

Interaction protéine/nucléoside  :

Girke C, Arutyunova E, Syed M, Traub M, Möhlmann T, Lemieux MJ. High yield expression and purification of equilibrative nucleoside transporter 7 (ENT7) from Arabidopsis thaliana. Biochim Biophys Acta. 2015 1850(9):1921-9. doi: 10.1016/j.bbagen.2015.06.003. Epub 2015 Jun 12. PubMed PMID: 26080001.

Interaction protéine/ion :

Parker JL, Newstead S. Molecular basis of nitrate uptake by the plant nitrate transporter NRT1.1. Nature. 2014 507(7490):68-72. doi: 10.1038/nature13116. Epub 2014 Feb 26. PMID: 24572366