Entretien avec Marie-Noëlle Vaultier, enseignante-chercheuse et Audrey Nuyttens, assistante ingénieure à l'Université de Lorraine au sein de l’UMR Silva (Université de Lorraine, AgroParisTech, INRAE).
Vous êtes enseignante-chercheuse, assistante ingénieure à l'Université de Lorraine, quels sont vos domaines d'activités respectifs et en quoi consistent vos recherches ?
Marie-Noëlle Vaultier, Maître de Conférences à l’Université de Lorraine, enseigne à la faculté de Pharmacie et effectue ses recherches au sein de l’UMR Silva. Elle fait partie de l'équipe de recherche PHARE (PHysiologie de l'Arbre en Réponse à l'Environnement). Experte dans l’enseignement de la botanique et de la mycologie, son domaine de recherche concerne la physiologie végétale ; elle travaille sur l'étude des mécanismes moléculaires et cellulaires mis en place lors de la réponse à un stress oxydatif généré par une ou plusieurs contraintes abiotiques (augmentation de la concentration atmosphérique en ozone, sécheresses, canicules…) ou biotiques (attaques de pathogènes…). Ses connaissances biomoléculaires et en signalisation cellulaire l'ont amenée à participer au projet Gemm_Est. Elle y réalise des recherches dont l'objectif est de comprendre les différents mécanismes mobilisés en réponse au stress provoqué par la blessure liée au gemmage. En effet, les mécanismes moléculaires sont en partie identiques aux mécanismes mis en place lors de la réponse à un stress biotique (réponse aux pathogènes).
Audrey Nuyttens, assistante ingénieure au sein de l’UMR Silva, fait également partie du personnel de recherche de l’équipe PHARE mais aussi de l'équipe ForeSTree (Forest, Stand, Tree). Spécialisée dans le domaine de la biochimie, elle est experte dans l'utilisation de l'appareil HPLC-MS (appareil qui permet d’identifier et de quantifier des substances organiques non-volatiles dans diverses matières), faisant partie de la plateforme ASIA (Approches fonctionnelles et Structurales des InterActions cellulaires). Ses compétences en biologie moléculaire et en biochimie et en techniques d’analyse l'ont ainsi naturellement conduite à participer aux recherches menées dans le projet Gemm_Est.
Pouvez-vous nous dire ce qu'est un ARN et plus spécifiquement en quoi consiste un ARN messager ? Quelle est la différence entre un ARN et un ADN ?
L'ADN (acide désoxyribonucléique) est le support de l’information génétique présente notamment dans le noyau des cellules des êtres vivants (dont les arbres). L’ADN se présente sous la forme d’un double brin, constituant une double hélice. Il contient ainsi l’information permettant le développement, le fonctionnement et la reproduction des êtres vivants. Ces phénomènes sont rendus possibles notamment par la présence et l’action, dans les cellules, de protéines : protéines composant les structures ou protéines-enzymes qui permettent les réactions biochimiques.
L'ARN (acide ribonucléique), quant à lui, est un intermédiaire entre l’ADN et ces protéines ; on parle d'ARN messager pour qualifier ce rôle d’intermédiaire. L'ARN est ainsi une sorte de copie (on parle plutôt de transcription) d'une région de l'un des brins de l'ADN (contenant un ou plusieurs gènes) et se présente sous la forme d’un simple brin. On retrouve les ARN dans le cytoplasme des cellules et non dans le noyau comme pour l’ADN.
De plus, les ARN messagers sont soit présents en permanence dans les cellules vivantes de l’arbre (dans les cellules du bois en ce qui nous concerne) soit y sont présents à certains moments, dans le but de réagir à un stress, dû à une agression venant de l’environnement extérieur comme par exemple une blessure.
Pourquoi extrait-on les ARN messagers à partir des échantillons de bois lors des recherches réalisées sur le gemmage ?
Au départ, nous ne connaissons pas les parties de l’ADN qui sont réactivées suite à la blessure. Par contre, dans le cytoplasme des cellules, on peut retrouver les ARN messagers qui ont été produits pour initier le phénomène de défense. En caractérisant la structure des ARN messagers il est possible de remonter à la structure des parties de l’ADN (les gènes) à partir desquels ils ont été transcrits. Ainsi les ARN messagers sont extraits en vue d’identifier les gènes qui ont été réactivés suite à la blessure due au gemmage.
On fait l’hypothèse que ces ARN messagers sont en quantité plus importante dans les arbres gemmés que dans les arbres non gemmés, ce qui témoigne d’une réactivation des gènes codant pour ces ARN messagers dans les arbres gemmés.
Selon cette approche méthodologique, il est en particulier possible d’établir les liens entre les composants chimiques de la gemme, déjà identifiés et quantifiés, et les gènes codant pour les protéines-enzymes impliquées dans les voies de biosynthèse de ces composés chimiques.
Dans le cadre de Gemm_Est, cette étude constitue une poursuite du travail réalisé par Sébastien Ribeiro, post-doctorant qui a mené les expérimentations sur pin sylvestre durant les deux années du projet Gemm_Est.
Comment faites-vous pour récupérer des ARN messagers lors d'une blessure sur un arbre et quel est votre protocole de recherches ? A quoi vont servir les ARN messagers récupérés ?
Tout d’abord, des échantillons (carottes de bois) ont été prélevés dans la partie externe du tronc de l’arbre à l’aide d’un outil appelé tarière à la fois sur des arbres gemmés et sur des arbres non gemmés. Pour extraire ensuite les ARN messagers à partir de ces échantillons, ces derniers ont été broyés dans l’azote liquide afin d’obtenir une poudre fine de bois, permettant un accès plus facile des réactifs (CTAB) aux cellules.
Les étapes d’extraction et de purification des acides nucléiques qui s’ensuivent sont absolument déterminantes : le rendement et la pureté des acides nucléiques sont en effet deux paramètres importants pour assurer l’efficacité et la fiabilité de la suite de l’analyse de l’expression des gènes. Il est à noter que les rendements et la pureté sont assez variables d’un échantillon à l’autre, sans que l’on sache vraiment pourquoi.
Le protocole mis en place pour l’extraction des ARN messagers à partir des échantillons de poudre de bois comporte quatre étapes principales :
- la lyse des cellules ;
- la dénaturation des protéines et des complexes nucléoprotéiques ;
- l’inactivation des nucléases ;
- la purification des acides nucléiques (ARN).
Les cellules contenues dans les échantillons, vont être lysées (action de destruction des cellules) grâce à différentes méthodes : une méthode chimique par l’utilisation d’un détergent comme le CTAB (bromure de cétyltriméthylammonium) et une méthode mécanique (billes de broyage). Le CTAB est un tensioactif très utilisé qui dissout la membrane plasmique qui entoure les cellules et ainsi provoque leur lyse, permettant ainsi de libérer les molécules (notamment les acides nucléiques) contenues à l’intérieur.
Les acides nucléiques seront ensuite extraits à l’aide de chloroforme, permettant de les séparer des différents débris cellulaires tels que les protéines, les lipides ou encore les polysaccharides. Plusieurs étapes de centrifugation compléteront l’extraction et les acides nucléiques seront ensuite purifiés après plusieurs lavages à l’éthanol.
L’étape de purification est essentielle, car elle permet d'éliminer les impuretés qui peuvent inhiber certaines enzymes utilisées pour la suite de l’étude. C’est le cas particulièrement des enzymes utilisées pour l’amplification des gènes par PCR (réaction de polymérisation en chaîne permettant de mesurer le niveau d’expression de gènes d’intérêt).
La PCR consiste à utiliser les ARN messagers récupérés pour réaliser une transcription inverse qui va conduire à la production de fragments d’ADN bien identifiables, identiques à ceux dont étaient issus les ARN messagers, qui eux n’étaient pas connus au départ.
D'après vous qu'apportent les différentes recherches expérimentées sur la pratique du gemmage ?
Notre étude sur l’expression des gènes et les mécanismes moléculaires en réponse au gemmage participe à une meilleure compréhension des mécanismes fondamentaux mis en œuvre dans le cadre général des réponses de défense de l’arbre. Ce mécanisme de défense, mobilisé suite à la blessure occasionnée par le gemmage, est en effet assez similaire à celui déclenché par l’attaque de pathogènes.
Par ailleurs, les différentes recherches réalisées à propos du gemmage, permettent une recontextualisation de cette pratique, tenant compte des évolutions techniques récentes (récupération de la gemme en vase clos, utilisation comme activateurs d’acides organiques faibles plutôt que l’acide sulfurique), des préoccupations environnementales actuelles (maintien de la santé des arbres gemmés) et surtout du souci d’améliorer les conditions sanitaires du travail du gemmeur.
Marie-Noëlle Vaultier
Enseignante-chercheuse en physiologie forestière à l’Université de Lorraine.
Maître de conférences (habilitée à diriger les recherches) au sein de l’UMR Silva, Marie-Noëlle Vaultier étudie la physiologie intégrative de la réponse au stress. Marie-Noëlle travaille sur l’étude des mécanismes moléculaires et cellulaires mis en place chez les arbres lors de la réponse à un stress oxydatif généré par une ou plusieurs contraintes abiotique.
Audrey Nuyttens
Assistante ingénieure en biologie moléculaire, biochimie et HPLC-MS à l’Université de Lorraine.
Assistante ingénieur à l’UMR Silva, Audrey Nuyttens est spécialisée en biologie moléculaire et en biochimie. Audrey est également la référente pour l’utilisation de l’appareil HPLC-MS de la plateforme ASIA.
