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Dernière mise à jour : Mai 2018

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Consortium Public/Privé Recherche - Développement - Innovation sur le Biocontrôle

Site Internet du consortium public-privé Recherche - Développement - Innovation sur le biocontrôle

Projet BACILLUS

Évaluer in vivo la production d’entérotoxines par des espèces de Bacillus.

Bacillus (forme végétative)
© Mathilde Bonis (ANSES)
Ce projet s’intéresse aux effets ‘indirects’ des toxines des bactéries Bacillus, largement utilisées comme produit de biocontrôle, sur des organismes non cibles, dont les mammifères et permettra à terme de développer un outil/une méthode pour évaluer le risque potentiel lié à l’utilisation d’agents de biocontrôle à base de Bacillus, en cas de libération d’entérotoxines, susceptibles de causer des pathologies.

Contexte

De nombreuses espèces de bactéries de la famille des Bacillus sont utilisées en biocontrôle, notamment pour la stimulation de la croissance des plantes et l’activation de leurs défenses. Les Bacillus sont également utilisés pour produire des molécules aux propriétés antibiotiques, antifongiques et des toxines entomopathogènes. De plus, les Bacillus ont la capacité de former des endospores (de petites structures cellulaires qui assurent la survie des bactéries en cas de stress environnemental) faciles à produire, à stocker et transporter.

Spores Bacillus

Cependant, certaines espèces peuvent produire et libérer dans l’organisme des substances toxiques (entérotoxines) après ingestion. Bacillus cereus (Bc), peut déclencher des symptômes diarrhéiques ou émétiques. Les symptômes diarrhéiques sont provoqués par la synergie entre trois entérotoxines (Nhe, Hbl et CytK) sécrétées par les Bc sous leurs formes végétatives (forme sous laquelle la bactérie vit, se multiple et fabrique des toxines) dans l’intestin de l’hôte. Les symptômes émétiques sont quant à eux provoqués par l’ingestion de Céreulide, une toxine déposée par les cellules Bc végétatives dans les aliments. Paradoxalement, une souche de Bc (souche AR156) a été identifiée comme un produit d’intérêt en biocontrôle car il stimule les défenses des plantes. 

Un autre exemple c'est B. thuringiensis (Bt), utilisé comme bioinsecticide à l’échelle mondiale. Les produits à base de Bt ciblent des lépidoptères ravageurs de cultures ou les moustiques. Cependant, Bt porte également des gènes codant pour les mêmes entérotoxines que Bc.

Dans ce contexte, le projet BACILLUS vise à tester 1) si des entérotoxines sont libérées dans l'intestin d'organismes non cibles et 2) si l'expression des gènes codant ces entérotoxines et/ou la libération de ces entérotoxines par les bactéries dépendent de l’hôte. Réalisée in vivo, l’approche proposée dans le cadre du projet pourra être transposée à tous types de Bacillus susceptibles d’être ingères avec la nourriture, qu’il s’agisse de produits de biocontrôle ou même de probiotiques.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de caractériser in vivo sur un organisme modèle, la mouche Drosophila melanogaster, la toxicité intestinale de différentes souches de Bc et Bt à travers :

1. Le suivi des niveaux d’expression des gènes codant ces entérotoxines.

2. La quantification de la sécrétion de ces entérotoxines dans l’intestin de D. melanogaster.

Ces résultats permettront à terme de développer une méthodologie pour évaluer la toxicité intestinale des spores (forme de résistance de la bactérie) des espèces de la famille des Bacillus.

Stratégies / Méthodes

Étape 1. Développement d’une méthodologie pour évaluer la toxicité intestinale des spores de 2 espèces de Bacillus.

Question :  Bc et/ou Bt induisent-ils des lésions intestinales ?

Plan expérimental : Concevoir une méthode générique, fiable et reproductible pour nourrir l’organisme modèle étudié, la mouche D. melanogaster, avec des spores de Bacillus afin de déterminer la toxicité intestinale. Cette méthode sera applicable à toutes les spores de Bacillus.

- La production des spores de Bc et Bt est maîtrisée au laboratoire. Ces spores serviront à faire la preuve du concept.

- Les spores seront mélangés à la nourriture des mouches puis la quantité de bactéries sera mesurée dans l’intestin à différents temps post-ingestion.

- La toxicité intestinale sera mesurée en comptabilisant la mortalité cellulaire au niveau de l’intestin (apoptose des entérocytes), l’apparition de spasmes viscéraux et de diarrhées. Des essais de type dose-réponse seront également réalisés pour quantifier l’apparition de ces symptômes en fonction de la quantité de spores bactériennes ingérées.

Étape 2. Monitoring des niveaux d’expression des entérotoxines Bc/Btin vivo dans l’intestin.

Question :  Bc et/ou Bt expriment-ils dans l’intestin des gènes codant pour des entérotoxines?

Plan expérimental :  L’expression des gènes de Bc et Bt codant pour des entérotoxines sera mesurée par des approches de biologie moléculaire (RT-qPCR) à diffèrent temps post-ingestion. Cette expression sera ramenée à la quantité de spores ingérées et aux éventuels symptômes observés, en fonction des données obtenues à l’étape 1.

Étape 3. Évaluation de la production d’entérotoxines in vivo.

Question : Les Bacilles Bc et/ou Bt libèrent-ils des entérotoxines dans la lumière de l’intestin ?

Plan de travail : Ce n’est pas parce qu’un gène codant pour une entérotoxine est exprimé que l’entérotoxine sera produite et/ou secrétée. En effet, on pense que l'expression du gène et la libération des toxines par les bactéries varie en fonction des conditions (ex. physico-chimiques ou de microflore) présentes dans l'organisme hôte. De plus, la quantité et le type d’entérotoxines libérées peuvent varier d'une souche de Bacillus à l’autre, ce qui peut occasionner des symptômes différents au niveau de l'intestin.

Après ingestion de différentes doses de spores (données obtenues dans les étapes 1 et 2), la production d’entérotoxines sera évaluée avec des kits de détection et si nécessaire, avec des anticorps dirigés contre spécifiquement les entérotoxines ciblées.

Diarrhea assessment colorimetric assay

 

Intestinal integrity  assessment Smurf assay

                 

Type de projet 

Contrat postdoctoral de 18 mois.

Coordinateurs

Armel GALLET, e-mail : Armel.GALLET@univ-cotedazur.fr

Organisme d’accueil : UMR INRA 1355/CNRS 7254/Université Côte d'Azur

Laboratoire/Unité : Institut Sophia Agrobiotech (Sophia Antipolis)

Partenaires

Bacillus team – Staphylococcus, Bacillus and Clostridium unit – Food safety laboratory - ANSES